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{{voir homonymes|SAF}}
'''La microscopie de fluorescence supercritique''' ('''SAF''', ''{{lang|en|Supercritical angle fluorescence microscopy}}'') est une technique particulière de [[Microscope à fluorescence|microscopie optique à fluorescence]] permettant l'observation spécifique d'une tranche supérieure ultra fine d'un échantillon (moins de 100 nm d'épaisseur). Cette technique, plus sélective encore que la [[Microscope de fluorescence par réflexion totale interne|microscopie de fluorescence par réflexion totale interne]] (TIRF, limitée à 200 nm), permet de dépasser les limites théoriques que devrait imposer la [[diffraction de la lumière]] grâce à une observation dans les angles supercritiques. La méthode a été inventée en 1998 dans les laboratoires de Stefan Seeger<ref name=":0">{{Article |langue=EN |auteur1= |prénom1=Jörg |nom1=Enderlein |prénom2=Thomas |nom2=Ruckstuhl |prénom3=Stefan |nom3=Seeger |titre=Highly efficient optical detection of surface-generated fluorescence |périodique=Applied Optics |volume=38 |numéro=4 |date=1999-02-01 |issn=2155-3165 |doi=10.1364/AO.38.000724 |lire en ligne=https://www.researchgate.net/profile/Stefan_Seeger3/publication/5546116_Highly_Efficient_Optical_Detection_of_Surface-Generated_Fluorescence/links/54e760120cf2cd2e0293e93d/Highly-Efficient-Optical-Detection-of-Surface-Generated-Fluorescence.pdf |consulté le=2020-06-03 |pages=724–732 }}</ref> à l'[[université de Ratisbonne]] en [[Allemagne]] et plus tard à l'[[université de Zurich]] en Suisse.  

== Principe de fonctionnement de la microscopie SAF ==
[[Fichier:Polarplotsaf-FR.png|vignette|307x307px|Diagrammes polaires de l'émission de fluorescence à l'interface eau/verre. La SAF n'est émise efficacement que si les émetteurs sont très proches de l'interface.]]
La microscopie SAF utilise une particularité des diffusions de lumière très proches d'une surface de verre. En effet, le comportement de rayonnement des molécules fluorescentes est fortement influencé lorsqu'elles se trouvent à proximité immédiate d'interfaces d'indices de [[réfraction]] différents<ref>{{Article |langue=en |auteur1=Lukosz, W |auteur2=Kunz, R. E. |titre=Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. I. Total radiated power |périodique=JOSA |volume=67 |numéro=12 |date=1977 |issn= |lire en ligne=https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/46330548/JOSA.67.00160720160607-12624-rrivd2.pdf?1465366521=&response-content-disposition=inline%3B+filename%3DLight_emission_by_magnetic_and_electric.pdf&Expires=1591123074&Signature=PasoON-CF8uLckX65RuWXyne9BdQxro7cuR0cyybRB8s4aDOqShpjBHUE~oYUa4DY763GqINHuuJLDf~K2NEdU6LXSLker9h8SirJXFDl51AipOhcp-Of9kUCTkjABRDiJGLOJt0jONmr~9gccDzVlRnLjXyRIGVmCgElix7suwGpANdtp6P9xL58inLrk03GLmoUHAUbkGrGp2gnaJ0XudenPyYoAIX6BGUCpEIvpj7uELKcAg14DuJies5Nur3~XfalNIAaSl8cQTPx4EmZakvt7RRwgqI5-dTDHuOhsb7EcA0TsRm4-YUPdIhQMRokCxROHX9sCJweal2XTHSvg__&Key-Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA |pages=1607-1615 }}</ref>{{,}}<ref>{{Article |langue=en |auteur1=Lukosz, W |auteur2=Kunz, R. E. |titre=Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. II. Radiation patterns of perpendicular oriented dipoles |périodique=JOSA |volume=67 |numéro=12 |date=1977 |issn= |lire en ligne=https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/46330549/JOSA.67.00161520160607-12326-9308dr.pdf?1465366522=&response-content-disposition=inline%3B+filename%3DLight_emission_by_magnetic_and_electric.pdf&Expires=1591123163&Signature=gwOr-9vjAQd1KXlg6yKe5n~LGiQVtZXHBdJ0rvA2v-XsRSjSk1N5E-50SU1chZk8bJuqhbhOzSS2wxq5cvFfwq-BfnJ6kOeheok~1tlqxlzys3a48ME0KWGglheHfjf2ZSeXnI-Zztxgam2A23LZHobILnbTrehiubVUC1LpYYmEMhXow-XpxN2fMOImsN6Sv24oRJBMCbNmEoRNjnJC0Ztkjqu7-giB2yEs-sjx~9PO46qwqK8hrAwJPoGVE01RNnqLaMhye0E0TpzWjaaczsaoWb~KPtP6Om5R6v6NBwldxt5PNzfzatdoAQYFca9uiN9eFp8t0sDtU05tIvQQ4Q__&Key-Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA |pages=1615-1619 }}</ref>. Ainsi, Lorsqu'une particule fluorescente s'approche fortement de la surface de verre, elle n'émet pas de lumière dans toutes les directions (on dit qu'il n'y a pas d'émission [[Isotropie|isotrope]]). Environ 70% de la fluorescence émise se trouve alors dirigée dans le verre au-dessus de l'[[Réflexion totale|angle critique]]<ref name=":0" /> (angle à partir duquel la lumière n'est plus réfractée mais est réfléchie entre le verre et l'eau de l'échantillon<ref>En microsocpie avec des échantillons biologiques, les particules fluorescentes sont généralement situées dans un milieu aqueux (indice de réfraction <math>n_0=1{,}33</math>) sur une lame de verre de microscope (indice de réfraction <math>n_1=1{,}52</math>). L'angle critique <math>\theta_{\mathrm c}</math> de l'interface eau/verre est alors de 61°.</ref>). A contrario, si la distance de l'émetteur fluorescent s'éloigne à seulement 200 nm au-dessus de la surface, la lumière fluorescente pénétrant dans le verre au-dessus de l'angle critique diminue considérablement. Par conséquent, la microscopie SAF est idéalement adaptée pour distinguer les molécules et les particules sur ou à proximité des surfaces et de tout autre échantillon présent dans la masse <ref>{{Article |langue=en |auteur1= |prénom1=Thomas |nom1=Ruckstuhl |prénom2=Michael |nom2=Rankl |prénom3=Stefan |nom3=Seeger |titre=Highly sensitive biosensing using a supercritical angle fluorescence (SAF) instrument |périodique=Biosensors and Bioelectronics |volume=18 |numéro=9 |date=2003-08-15 |issn=0956-5663 |doi=10.1016/S0956-5663(02)00239-7 |lire en ligne=https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/43341304/Highly_sensitive_biosensing_using_a_supe20160304-14866-24ll39.pdf?1457078668=&response-content-disposition=inline%3B+filename%3DHighly_sensitive_biosensing_using_a_supe.pdf&Expires=1591195293&Signature=V2QzxExOS1Zl4AZEyVdLDjwF12a1uHIrRzcJrH6nwSfH-o4cnja98ZtQabAaHVUZrQr2HGIH99lOFxJFa24ZyzAMeo1v2LmMH3OVdysQ8NhYI163l8pxm~YWVd4DSvVRmbZJ-vosKLyXwMSt5sE-Ii5qP859XuSB7GeLtXoxD7GOstgPNAiRiFRDt6G0beGKQHRCwY6xk5y4d5-EYtygon47CGWLe9c-VVPSlPbfI3tTJM9daFSPb3oaV5YmRPlbhTODJDq6ZNXE1D7OAmWilBzIuYpo5fpbrMRCdtRWfWXnVY2tE9Dufc~hw~NBzIoKRyh7I0WghUMvcyZ3hCsXtQ__&Key-Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA |consulté le=2020-06-03 |pages=1193–1199 }}</ref>{{,}}<ref>{{Article |langue=EN |prénom1=Thomas |nom1=Ruckstuhl |prénom2=Stefan |nom2=Seeger |titre=Attoliter detection volumes by confocal total-internal-reflection fluorescence microscopy |périodique=Optics Letters |volume=29 |numéro=6 |date=2004-03-15 |issn=1539-4794 |doi=10.1364/OL.29.000569 |lire en ligne=https://www.osapublishing.org/ol/abstract.cfm?uri=ol-29-6-569 |consulté le=2020-06-03 |pages=569–571 }}</ref>.

== Utilisation ==
Les microscopes SAF permettent d'observer des processus membranaires et d'adhésion dans les cellules vivantes<ref>{{Lien web|titre=Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay - UMR 8214 - Microscopie de fluorescence supercritique (SAF)|url=http://www.ismo.u-psud.fr/spip.php?rubrique304|site=www.ismo.u-psud.fr|consulté le=2020-05-29}}</ref> en détectant et caractérisant les espèces fluorescentes (protéines, biomolécules, produits pharmaceutiques, etc.) et leurs comportements proches voire [[Adsorption|adsorbés]] ou liés en surface. La méthode est capable d'observer des molécules à une distance de 100 à 0 nanomètre de la surface, même en présence de fortes concentrations d'espèces fluorescentes aux alentours.  

En combinant deux dispositifs sur l'objectif du microscope, la technique SAF permet la détection séparée de la fluorescence de la masse de l'échantillon (détectée par les microscopes à fluorescences classiques) et de sa zone de contact avec le verre de support (lame de microscope) dont la lumière est émise au-dessus de l'angle critique. Dans le cas de l'observation d'une cellule vivante, cette double observation permet de bien séparer les processus membranaires du reste corps cellulaire.  

En plus de cette utilisation, la microscopie SAF pourrait permettre de mesurer l'[[indice de réfraction]] d'une cellule<ref>{{Article |langue=en |prénom1=Maia |nom1=Brunstein |prénom2=Lopamudra |nom2=Roy |prénom3=Martin |nom3=Oheim |titre=Near-Membrane Refractometry Using Supercritical Angle Fluorescence |périodique=Biophysical Journal |volume=112 |numéro=9 |date=2017-05-09 |issn=0006-3495 |doi=10.1016/j.bpj.2017.03.008 |lire en ligne=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006349517302977 |consulté le=2020-06-03 |pages=1940–1948 }}</ref> et par ce biais la présence de [[bactérie]] sans marquage fluorescent dans un échantillon extrêmement petit<ref>{{Article |prénom1=Boris |nom1=Ferdman |prénom2=Lucien E. |nom2=Weiss |prénom3=Onit |nom3=Alalouf |prénom4=Yonathan |nom4=Haimovich |titre=Ultrasensitive Refractometry via Supercritical Angle Fluorescence |périodique=ACS Nano |volume=12 |numéro=12 |date=2018-12-26 |issn=1936-0851 |doi=10.1021/acsnano.8b05849 |lire en ligne=https://doi.org/10.1021/acsnano.8b05849 |consulté le=2020-06-03 |pages=11892–11898 }}</ref>.

== Dispositif SAF typique ==
[[Fichier:SAF_-_set-up-fr.jpg|droite|vignette|300x300px| Dispositif SAF typique. La lumière fluorescente à angle supercritique est collectée et mesurée par la diode à avalanche APD #2. Les rayons d'incidence sous-critiques sont mesurés avec APD #1.]]
Pour la microscopie SAF, on utilise un objectif de microscope spécial, qui comprend un miroir parabolique et une [[lentille asphérique]] pour obtenir une grande [[ouverture numérique]]. Ces deux dispositifs permettent une microscopie parallèle avec deux résolutions différentes le long de l'axe optique<ref>{{Article |langue=en |auteur1=Ruckstuhl, T. |auteur2=Verdes, D |titre=Supercritical angle fluorescence (SAF) microscopy |périodique=Optics express |volume=12 |numéro=12 |date=2004 |issn= |lire en ligne=https://www.researchgate.net/profile/Dorinel_Verdes/publication/26254842_Supercritical_angle_fluorescence_SAF_microscopy/links/5502e3db0cf2d60c0e64beca/Supercritical-angle-fluorescence-SAF-microscopy.pdf |pages=4246-4254 }}</ref>{{,}}<ref>{{Article |langue=en |auteur1=Verdes, D |auteur2=Ruckstuhl, T |auteur3=Seeger, S |titre=Parallel two-channel near-and far-field fluorescence microscopy |périodique=Journal of biomedical optics |volume=12 |numéro=3 |date=2007 |issn= |lire en ligne=https://pdfs.semanticscholar.org/7174/741cde0eef71f0cec4e31ca277e1c2052177.pdf |pages=034012 }}</ref>.  La lumière fluorescente est ainsi recueillie par ces deux dispositifs parallèles sur des détecteurs, généralement un [[tube photomultiplicateur]] ou un détecteur à [[photodiode]] à avalanche . Il est également possible d'organiser les éléments SAF sous forme de tableaux et d'imaginer la sortie sur une caméra CCD, permettant la détection de plusieurs analytes <ref>{{Article |auteur1=Hill |prénom1=D |auteur2=McDonnell B |auteur3=Hearty S |auteur4=Basabe-Desmonts L |titre=Novel disposable biochip platform employing supercritical angle fluorescence for enhanced fluorescence collection. |périodique=Biomedical Microdevices |volume=13 |numéro=4 |date=11 May 2011 |pmid=21559870 |doi=10.1007/s10544-011-9546-2 |pages=759–67 }}</ref>. 

La [[fluorescence]] émise par l'échantillon est ainsi collectée par deux canaux. D'une part la lumière est recueillie par la lentille asphérique pour voir la masse de l'échantillon permettant d'avoir une microscopie de fluorescence classique. D'autre part, les émissions fluorescentes sont aussi recueillies par une optique parabolique au-dessus de l'angle critique de [[Réflexion totale|réflexion interne totale]] de manière sélective permettant de discriminer les émissions en surface.

Pour éclairer les échantillons, la lumière d'un laser est réfléchie dans la lentille asphérique par un [[miroir dichroïque]]. La lentille asphérique concentre le faisceau laser dans l'échantillon, provoquant la fluorescence des particules.

== Notes et références ==
{{Références}}

== Liens externes ==
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